idepのinputとして発現量テーブル（gene × sample）をexperiment matrixから自動でつくる。salmonを用いる。

ikraのtximport_R.Rにサンプルを取り違えうる重大なバグが見つかり、修正しました。最新版に更新してお使いください。古いバージョンを使われていた方は、中間ファイルは問題ありませんので、output.tsvおよびexperiment matrixと同じディレクトリにコピーされているtximport_R.Rを削除し、もう一度新しいikra.shを実行してください。大変ご迷惑をおかけいたしました。

Usage: ikra.sh experiment_table.csv species \
        [--test, --fastq, --help, --without-docker, --udocker --protein-coding] \
        [--threads [VALUE]][--output [VALUE]]\
        [--suffix_PE_1 [VALUE]][--suffix_PE_2 [VALUE]]
  args
    1.experiment matrix(csv)
    2.reference(human or mouse)

Options:
  --test  test mode(MAX_SPOT_ID=100000).(dafault : False)
  --fastq use fastq files instead of SRRid. The extension must be foo.fastq.gz (default : False)
  -u, --udocker
  -w, --without-docker
  -pc, --protein-coding use protein coding transcripts instead of comprehensive transcripts.
  -t, --threads
  -o, --output  output file. (default : output.tsv)
  -s1, --suffix_PE_1    suffix for PE fastq files. (default : _1.fastq.gz)
  -s2, --suffix_PE_2    suffix for PE fastq files. (default : _2.fastq.gz)
  -h, --help    Show usage.
  -v, --version Show version.

• test optionは各サンプルにおいてリード数を100000に限定する。
• udocker modeはUser権限しか使えないサーバー環境用。詳しくはhttps://github.com/indigo-dc/udocker。
• without-docker modeはすべてのツールをインストールした状態で動く。非推奨。
• protein-coding modeはgenesをprotein coding genesのみに限定する。
• threads
• outputはデフォルトではoutput.tsv。

experiment matrixはカンマ区切りで（csv形式）。

SRR mode

fastq mode

• nameはアンダーバー区切りでcondition、replicateをつなげて書く。

• 前3列は必須。

• 自前のfastq fileを使いたいときは--fastqをつける。拡張子は.fq, .fq.gz, .fastq, fastq.gzのみに対応。

• fastq fileはfastq.gzもしくは_1.fastq.gz,_2.fastq.gzを除いたpathを。例えばhoge/SRR5385247.fastq.gzならhoge/SRR5385247と記載。

• suffixが_1.fastq.gz,_2.fastq.gzではない場合は-s1, -s2オプションをつける。

• ../fq/**.fastq.gzなど、実行ディレクトリより上の階層を指定することはdockerの都合上不可能だが、symbolic linkを貼ることで回避できる。 bonohu blog

• Illumina用 : trimmomatic -> trim_galoreに切り替えた。

• Ion S5用: SEしか無い。trimmomaticではなくfastx-toolsを使う。adapterはNoneを入れておく。(test : DRP003376)

• output.tsv(scaledTPM)

• multiqc_report.html salmonのマッピング率（トランスクリプトに対するマッピング率）

• outputはscaledTPM (see. Soneson, C., Love, M. I. & Robinson, M. D. Differential analyses for RNA-seq: transcript-level estimates improve gene-level inferences. F1000Research 4, 1521 (2015).)。
• GCbiasについて、salmonで--gcBiasを追加した。GCbiasのRNAseqにおける影響に関してはMike Love's blog : RNA-seq fragment sequence bias。
• validateMappings optionを採用。（alignment-base modeでは使えない。）詳しくはsalmon Frequently Asked Questions。

ikraのtximport_R.Rにサンプルを取り違えうる重大なバグが見つかり、修正しました。必ずv1.1.1以降に更新してお使いください。古いバージョンを使われていた方は、中間ファイルは問題ありませんので、output.tsvを削除し、もう一度新しいikra.shを実行してください。大変ご迷惑をおかけいたしました。

dockerかudocker(v1.1.3)をインストール済みであること。 もしくはどちらも使いたくない場合は、すべてのソフトを手動でインストールして、--without-dockerを用いる。 shell scriptなのでcloneするだけ。

$ git clone https://github.com/yyoshiaki/ikra.git

SRR mode

$ cd test/Illumina_SE && bash ../../ikra.sh Illumina_SE_SRR.csv mouse --test -t 10

fastq mode

SRR modeを実行したあとしかできない。（fastqはつけていないから。）

$ cd test/Illumina_SE && bash ../../ikra.sh Illumina_SE_fastq.csv mouse --fastq -t 10

SRR mode

$ cd test/Illumina_PE && bash ../../ikra.sh Illumina_PE_SRR.csv mouse --test -t 10

fastq mode

SRR modeを実行したあとしかできない。（fastqはつけていないから。）

$ cd test/Illumina_PE && bash ../../ikra.sh Illumina_PE_fastq.csv mouse --fastq -t 10

書きを実行できてからcommitすべし。

$ cd test && bash test.sh

$ cd test/Ion && bash ../../ikra_Ion_SRR.sh Ion_SRR.csv mouse

salmonがmacで走らない問題だが、DBCLS大田さんに解決していただいた。macではdefaultで2Gbしかメモリをdockerに振っていないことが原因らしい。写真のように、8Gb等大きめのメモリ量を割り振って、Apply & Restartすると解決する。

SRRデータを探している場合はhttp://sra.dbcls.jp/が爆速でおすすめ。

今後、ikra使用者から受け付けた質問への回答はこちらで公開してまいります。

• output.tsvをiDEPに読み込ませる場合は、Read counts dataにチェックを入れてください。
• mouseのリファレンスはgencode.vM21で、GRCm38に対応しております。

issueを参照のこと。

詳しくはRelasesを参照。

• udockerの対応
• 生物種の判別(アナログ)
• gtf, transcript file をGENCODEから
• salmon
• trimmomatic(legacy)
• trim_galore!
• tximport
• fastxtools(Ion用)
• fastqかSRRの判別(マニュアル)
• salmon gcbias correctionの導入
• salomn validateMappings
• pigz(gzipのマルチスレッド版)
• fasterq-dump
• cwl開発少しだけ
• 名前の変更（ikra）
• protein coding option

trimmomaticを使ったトリミングを用いたフローは./legacyに移動しました。

今はまだ完成とは言えないので各自

"development" branchの中 でFork -> Pull Request。直接masterは変えない。

• biocontainers : SNP-calling
• idep
• GENCODE
• salmon

2019/03/22 https://youtu.be/weJrq5QNt1M cwl作者のMichaelさんの来日配信に合わせてやってみた。 とりあえずPEでtrim_galoreとsalmonをcwl化した。

cd test/cwl_PE && bash test.sh

• https://github.com/pitagora-galaxy/cwl
• https://github.com/roryk/salmon-cwl